1.紫外-可見光譜鑒別法 多數(shù)有機(jī)藥物分子中含有能吸收紫外可見光的基團(tuán),從而顯示特征吸收光譜,這是紫外-可見光譜鑒別法的依據(jù)。鑒別時(shí)一般采用對(duì)比法,按規(guī)定的方法配制供試品溶液與對(duì)照品溶液,通過對(duì)比吸收光譜的特征數(shù)據(jù)、吸收度或吸收系數(shù)、吸收光譜的一致性等進(jìn)行鑒別。由于紫外-可見吸收光譜比較簡(jiǎn)單,光譜的曲線形狀變化不大,專屬性不如紅外光譜,同一物質(zhì)圖譜相同,但圖譜相同的卻不一定為同一物質(zhì)。但由于紫外-可見分光光度法比較方便,所以制劑的鑒別一般不采用紅外分光光度法,而采用紫外-可見分光光度法。
紫外-可見分光光度法應(yīng)用時(shí),主要有以下幾種方式。
(1)規(guī)定波長(zhǎng)處最大或最小吸收,一般是特征吸收波長(zhǎng)位置(λmax或λmin)。
如鹽酸偽麻黃堿鑒別項(xiàng)下要求“取本品,加水制成每1mL中含0.5mg的溶液,照紫外-可見分光光度法測(cè)定,在251nm、267nm與263nm的波長(zhǎng)處有最大吸收”。
如芬布芬鑒別項(xiàng)下要求“取本品,加無(wú)水乙醇制成每1mL中約含5μg的溶液,照紫外-可見分光光度法測(cè)定,在281nm的波長(zhǎng)處有最大吸收,在238nm的波長(zhǎng)處有最小吸收”。
(2)測(cè)定一定濃度的供試液在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度。
如棕櫚氯霉素鑒別項(xiàng)下要求“取本品,加無(wú)水乙醇溶解并定量稀釋制成每1mL中含20μg的溶液,照紫外-可見分光光度法測(cè)定,在271nm波長(zhǎng)處有最大吸收,其吸光度約為0.35”。
(3)吸收系數(shù)法:測(cè)定吸收波長(zhǎng),計(jì)算吸收系數(shù)。
如氫化可的松性狀項(xiàng)下要求“取本品,精密稱定,加無(wú)水乙醇溶解并定量稀釋制成每1m.中約含10μg的溶液,照紫外-可見分光光度法,在242mm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,吸收系數(shù)為422～448”。
(4)吸光度比值法:測(cè)定不同波長(zhǎng)處的吸光度,比值在一定范圍內(nèi)。可以是吸收峰與吸收峰的比值,也可以是吸收峰與吸收谷的比值。
如丙酸倍氯米松鑒別項(xiàng)下要求“取本品,精密稱定,加乙醇溶解并定量稀釋制成每1mL中約含20μg的溶液,照紫外-可見分光光度法測(cè)定,在239nm的波長(zhǎng)處有最大吸收,吸光度為0.57～0.60;在239nm與263nm的波長(zhǎng)處的吸光度比值應(yīng)為2.25～2.45”。
(5)樣品經(jīng)化學(xué)處理后,測(cè)定反應(yīng)生成物的吸收光譜特性。
以上方法可以單個(gè)應(yīng)用,為了提高鑒別的專屬性,也可以幾種方法結(jié)合起來(lái)使用,如丙酸倍氯米松的鑒別。
2.紅外光譜鑒別法 紅外光譜鑒別法是一種專屬性很強(qiáng)、應(yīng)用廣泛的方法,主要用于組分單一、結(jié)構(gòu)明確的原料藥,特別是結(jié)構(gòu)復(fù)雜、用其他常用方法不易區(qū)分的藥物,并且適用于固體、液體甚至是氣體的樣品鑒別。
應(yīng)用紅外光譜進(jìn)行鑒別試驗(yàn)時(shí),藥典采用標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)照法。在藥典規(guī)定的條件下測(cè)定供試品的圖譜,然后與國(guó)家藥典委員會(huì)編訂的《藥品紅外光譜集》對(duì)照。
《藥品紅外光譜集》分卷出版,分別為第一卷(1995年出版)、第二卷(2000年出版)、第三卷(2005年出版)、第四卷(2010年出版)。每次新版中收載的藥品紅外光譜圖包括新增品種和老品種重新繪制的圖譜。所以,如果同一化合物的圖譜在不同卷上均有收載時(shí),用于鑒別時(shí)以后卷圖譜作為比對(duì)依據(jù),前卷光譜圖僅作為參考。光譜圖中的橫坐標(biāo)為波數(shù)(cm-1),縱坐標(biāo)為透光率(T%)分辨率為2cm-1,基線一般控制在90%透光率以上,供試品取量一般控制在使其最強(qiáng)吸收峰在10%透光率以下。
原料藥的鑒別除另有規(guī)定外,應(yīng)按照《藥品紅外光譜集》各卷收載的各光譜圖所規(guī)定方法制備樣品。常用的制備方法有壓片法、糊法、膜法、溶液法、衰減全反射法和氣體法等。
組成相對(duì)穩(wěn)定的多組分原料藥鑒別不能采用全光譜比對(duì),需參照原料藥的標(biāo)準(zhǔn)光譜,在指紋區(qū)內(nèi)選擇主要成分的若干個(gè)特征譜帶作為鑒別的依據(jù)。
制劑鑒別應(yīng)按品種鑒別項(xiàng)下規(guī)定的前處理方法處理,通常是采用溶劑提取法。提取時(shí)應(yīng)選擇適宜的溶劑,盡可能減小輔料對(duì)鑒別結(jié)果的干擾,并且避免導(dǎo)致提取過程中藥物晶型的轉(zhuǎn)變。提取后的樣品經(jīng)適當(dāng)干燥后依法進(jìn)行鑒別。
在比對(duì)光譜時(shí)應(yīng)注意以下兒點(diǎn)。
(1)輔料無(wú)干擾,待測(cè)成分的晶型不變化時(shí),可直接與原料藥的標(biāo)準(zhǔn)光譜進(jìn)行比對(duì)。
(2)輔料無(wú)干擾,而待測(cè)成分的晶型有變化時(shí),可用對(duì)照品經(jīng)同法處理后的光譜比對(duì)。
(3)待測(cè)成分的晶型不變化,而輔料存在不同程度的干擾時(shí),可參照原料藥的標(biāo)準(zhǔn)光譜,在指紋區(qū)內(nèi)選擇3~5個(gè)不受輔料干擾的待測(cè)成分的特征譜帶作為鑒別的依據(jù)。鑒別時(shí),實(shí)測(cè)譜帶的波數(shù)誤差應(yīng)小于規(guī)定值的0.5%。
(4)待測(cè)成分的晶型有變化,輔料也存在干擾,此種情況一般不宜采用紅外光譜鑒別。
對(duì)照時(shí)一般先看最強(qiáng)峰的吸收位置、形狀、數(shù)目等是否一致,然后再檢查中等強(qiáng)度峰和弱吸收峰是否對(duì)應(yīng),如果供試品的紅外光吸收?qǐng)D譜與對(duì)照品的圖譜完全一致,一般可認(rèn)為是同一種化合物(只有少數(shù)例外,如有些光學(xué)異構(gòu)體或大分子同系物等)。若兩光譜圖不同,則可判定兩化合物不同。但是在實(shí)際操作中由于繪制圖譜時(shí)受藥物粉末細(xì)度、吸水程度、試樣的處理和制備等多種外界條件的影響較大,圖譜易發(fā)生變異,因此在圖譜對(duì)照時(shí),要充分考慮各種因素可能造成的影響。
藥典一般不單獨(dú)用本法進(jìn)行鑒別,常與其他理化方法聯(lián)合進(jìn)行鑒別。
如硫酸阿托品鑒別項(xiàng)下規(guī)定:①本品(試樣制備:KBr壓片法)的紅外光吸收?qǐng)D譜應(yīng)與對(duì)照的圖譜(《藥品紅外光譜集》一致;②本品顯托烷生物堿類的鑒別反應(yīng);③本品的水溶液顯硫酸鹽的鑒別反應(yīng)。